С XVI века возрастает значение нового общественного слоя — казачества, символом которого на украинских землях стала Запорожская Сечь. В 1591—1638 гг. происходит ряд казацко-крестьянских восстаний.
В 1648 г. украинские казаки поднимают восстание из-за отмены военного похода против Турции и социальной несправедливости. Казаков возглавляет шляхтич православной конфессии, украинец по происхождению Богдан Хмельницкий. Первоначально восставшим сопутствовал успех. Их поддержало Крымское ханство, которым тогда правил Ислям III Герай. В битве при Жёлтых Водах (1648) казацко-крымское войско (казаками командовал Хмельницкий, а крымцами — Тугай-бей) одержало победу, разбив польский отряд Степана Потоцкого. Вскоре последовала победа в Корсуньском сражении. В январе 1649 г. казаки торжественно входят в Киев, гетмана величают, а греческий патриарх дарует ему «Кресченый на Гробе Господним» меч. Богдан Хмельницкий устанавливает контроль над территорией большей части современной Украины. В 1651 г. происходит Берестецкая битва, в которой сошлись польская армия под предводительством короля Яна Казимира и Николая Потоцкого с одной стороны и союзные войска Богдана Хмельницкого и крымского хана Исляма III Гирея с другой стороны. Ислям Гирей покидает поле боя, а войска Богдана Хмельницкого терпят поражение. В августе того же года литовский гетман Радзивилл занимает Киев. В мае 1652 года около местечка Ладыжина, при урочище Батоге состоялась битва между казачьими войсками под командованием сына Богдана Хмельницкого Тимофея (Тымиша) и 20-тысячным польским войском под командованием гетмана Калиновского в результате которой польское войско было уничтожено.
Гетманщина в своем противостоянии с могущественной Речью Посполитой вынуждена была искать поддержки со стороны третьих стран. Наиболее успешными оказались переговоры с Русским Государством. В 1654 г. была созвана Переяславская Рада, просившая о принятии Войска Запорожского под протекторат московского царя (что впоследствии было названо историками «воссоединением Украины с Россией»). В соответствии с Переяславским договором (Переяславскими грамотами) русские войска поддержали гетмана Войска Запорожского, что привело к русско-польской войне. Вскоре выяснилось, что суть и смысл Переяславских соглашений каждая из сторон понимает по-своему. Украинцы, усвоившие стандарты ограниченной монархии, каковой являлась Речь Посполитая, считали обязательства подданных перед монархом и монарха перед поддаными взаимными. Они рассматривали Переяславские статьи как форму протектората московского царя над Украиной на условиях её широкой автономии. Русская сторона с её традицией абсолютизма и всевластия монарха была убеждена, что «царь перед своими подданными не ответчик». Идея украинской автономии, заложенная в Переяславле, таким образом вступала в прямой конфликт с российским абсолютизмом, что и продемонстрировали последующие события.
Осенью 1656 года Россия, не желая усиления Швеции из-за назревающего распада и раздела Речи Посполитой, останавливает военные действия против Речи Посполитой и проводит в Вильно сепаратные мирные переговоры, заключая 24 октября Виленское перемирие, хотя война Украины с Польшей продолжается по 1657 год. Хмельницкий, разочарованный в союзе с Русским государством, в свою очередь ищет новых союзников и в 1656 году вступает в военно-политический союз с Швецией и Трансильванией, невзирая на то, что Россия находится в состоянии войны с Швецией.
В 1658 году после смерти Богдана Хмельницкого гетман Иван Выговский формально разрывает Переяславский договор 1654 года и заключает Гадячский договор с Речью Посполитой. Польша, осознав, что окончательная утрата ею Левобережной Украины и Киева становится реальностью, формально декларирует готовность пойти навстречу стремлению украинцев получить большую самостоятельность в рамках Речи Посполитой, стать в ней полноправной стороной и защитить «греческую веру» от давления католиков. В 1658—1659 годах гетманские власти Правобережной Украины и Россия находятся в состоянии войны. В 1674 году гетман Правобережной Украины Дорошенко, принявший турецкий вассалитет, заперся в Чигирине и позвал на помощь турок, перед которыми казацко-московское войско Самойловича и Ромодановский поспешно отступило.
Несмотря на попытки Украины выйти из под влияния России, территория Украины по Андрусевскому перемирию 1667 г. и Вечному миру 1686 г. была разделена между Речью Посполитой и Россией. Таким образом, значительная часть территории была возвращена польской короне.
В ходе Северной войны гетман Мазепа принял решение о переходе на сторону Карла XII, короля Швеции, с которой Россия вела тогда войну. Мазепа рассчитывал найти поддержку среди реестрового казачества, в котором росло недовольство. Москвой в связи с тем, что Пётр I использовал этих профессиональных военных в качестве рабочей силы на строительстве Петербурга в болотистой северной местности в устье Невы. Однако попытка Мазепы сменить сюзерена для Украины с Петра I на Карла XII оказалась неудачной, поскольку не нашла поддержки ни у населения Украины, ни у казачества. Хотя Мазепа обещал Карлу 50 тысяч казачьего войска, к шведам ушло от 3 до 7 тысяч казаков, которые даже не принимали участия в Полтавской битве. 11 марта 1710 года царь Пётр I манифестом строго запретил оскорблять украинцев, попрекать их изменою Мазепы, угрожая в противном случае жестоким наказанием и даже смертною казнью.
Большую часть XVIII века Украина пользуется правами широкой автономии в составе Российской империи. В этот период на Украине происходит культурный подъём. На одной лишь Черниговщине число начальных («полковых») школ достигает в это время 6 сотен. В свою очередь, империя, испытывающая острый дефицит образованных кадров, широко привлекает для заполнения административных и церковных вакансий на её просторах выпускников Киево-Могилянской академии (по некоторым данным, число их в XVIII веке достигло 20 тысяч). Последним гетманом Украины стал Кирилл Разумовский, после чего институт гетманства упраздняется, а Украина входит в состав Российской империи. Непосредственной причиной этого стало польское восстание, вспыхнувшее после Первого раздела Польши 1772 года
